【期刊导读】CD8 T细胞耗竭评分可区分对体外免疫调节剂有不同应答能力的慢乙肝患者

编者按
HBV特异性CD8 T细胞在抗病毒保护中至关重要，HBV控制失败与特异性CD8 T细胞应答的严重受损有关。因此，重建有效的HBV特异性CD8 T细胞功能可能是慢性HBV感染的一种治疗策略。先前的研究证实了CXCR5+CD4+ T细胞在促进HBsAg血清学转换方面发挥重要作用，由干扰素α介导的T细胞重建有利于慢乙肝（CHB）患者获得完全应答（相关链接）。当干扰素α的长期治疗可能会引起CD8 T细胞的耗竭，从而影响治疗疗效，间歇治疗策略也正是基于此而设计，但目前间歇的时机仍难以准确的把握，当然，对于不同的体外免疫调节剂，都存在类似的问题，因此有效的判断CD8 T细胞的耗竭以及恢复重建的时间意义非常。

来自意大利的一项研究在Gut发表成果，探讨了CHB患者HBV特异性CD8 T细胞和总CD8 T细胞的功能异质性，评估这是否会影响患者对免疫调节策略的应答；并确定CD8 T细胞的功能和表型参数，以量化患者HBV特异性T细胞的受损情况，结果显示：CHB患者中耗竭的HBV特异性CD8 T细胞存在异质性，可根据其耗竭的程度确定对CHB患者分类的表型评分。严重耗竭的HBV特异性CD8 T细胞亚群的抑制性受体高表达，如PD-1、TOX和CD39；相反，在功能上占很大优势且有效的HBV特异性CD8 T细胞亚群的共抑制分子表达较低且具有更好的体外免疫应答。总CD8 T细胞表型分析可以反映HBV特异性CD8 T细胞的情况，因此基于总CD8 T细胞表型的耗竭评分，可区分具有不同抗病毒能力和对体外免疫调节剂应答不同的CHB患者。

研究方法

纳入376例CHB患者并筛选HLA-A2表达，共有160例HLA-A2+，其中60例可检测到core18-27 dextramer+ CD8 T细胞。71例HLA-A2+患者用含有pol序列455 - 463的聚合酶特异性dextramer进行检测，其中23例呈阳性。

最终HLA-A2+研究人群（64例）至少存在两种检测的CD8 T细胞表位之一，包括以下类别的患者：i）35例初治患者（CHB）；ii）16例从慢性HBV感染中自发恢复（自发血清学转换，SS）的免疫受试者；iii）13例NUC治疗获得HBsAg清除的患者（NUC-RES）。7例健康受试者（H）作为对照。

对dextramer+ CD8+ T细胞用细胞因子受体（CD127）、抗凋亡/细胞存活（Bcl-2和TCF-1）和T细胞耗竭（PD-1、TOX和CD39）标志物的抗体进行染色，以确定CD8+ T细胞分化的阶段。对dextramer+ CD8+ T细胞进行IFN-γ和TNF-α细胞内细胞因子染色（ICS），以评估HBV特异性CD8 T细胞的体外功能。根据HBV特异性CD8 T细胞表达的耗竭和记忆标志物的z-评分标准化中位荧光强度（MdFI）值计算耗竭评分（EI）。

研究结果

1. 严重耗竭的HBV特异性CD8 T细胞亚群的抑制性受体高表达

流式细胞术分析显示，与缓解受试者（NUC-RES和SS）及健康对照组相比，初治CHB患者的core18-27特异性CD8 T细胞上PD-1、TOX、CD39表达较高，Bcl-2、CD127表达较低，而TCF1在所有患者中的表达相似（图1B，C）。在CHB患者中，个体耗竭标志物（PD-1 vs TOX，CD39 vs TOX和CD39 vs PD-1）、个体分化/记忆标志物（Bcl-2 vs TCF1和CD127 vs Bcl-2）之间呈正相关；而耗竭标志物与分化/记忆标志物之间呈负相关（图1D）。

图1：HBV特异性CD8 T细胞的表型分析

根据PD-1、TOX、CD39、CD127、Bcl-2的z-标准化MdFI值生成耗竭评分（EI），通过EI对患者的CD8 T细胞耗竭总体水平进行量化，区分EI值低于或高于2的两组CHB患者队列，分别为72%（23例；图2A）和28%（9例；图2A，黄色方框内）。高EI值CHB患者组存在由PD-1high CD127low/-细胞组成的独特CD8 T细胞亚群，该细胞亚群在其余CHB患者组中不显著或完全阴性，在缓解组（NUC-RES和SS）中完全不存在（图2C，D）。高EI值与低EI值CHB患者的core18-27特异性CD8 T细胞中PD-1、TOX、CD39、Bcl-2和CD127的表达存在显著差异（图2E，F）。

图2：根据CD8 T细胞表达的耗竭和记忆/分化标志物对CHB患者进行分类

Pol455- 463特异性CD8 T细胞存在于部分慢性HBV感染患者中（11/45，24%）（图3A）。在CHB患者和缓解受试者中，其频率显著低于core18-27特异性CD8 T细胞（p < 0.0001，p = 0.0012；图3B，C）。在CHB患者中，相比于core18-27特异性CD8 T细胞，pol455-463特异性CD8+T细胞的TOX水平更高，PD-1水平更低（p = 0.0156，p = 0.07），而CD39、Bcl-2、TCF1、CD127的表达无显著差异（图3D）。CHB患者与缓解受试者的pol455-463特异性CD8+T细胞之间的耗竭和分化/记忆标志物的表达也没有显著差异（图3E）。总的来看，CHB患者中的pol455- 463和core18- 27特异性CD8 T细胞在外周血频率和表型参数方面存在显著差异，突出了两种不同的耗竭特征。

图3：core18-27特异性和pol455-463特异性CD8 T细胞的不同频率和表型

2. 低EI值CHB患者的HBV特异性CD8 T细胞在细胞因子产生方面更有效

体外分析core18-27特异性CD8 T细胞产生细胞因子的情况（图4A），pol455-463特异性CD8 T细胞因其极低的频率被排除。core18-27特异性CD8 T细胞的功能存在差异，部分CHB患者的细胞因子产生水平与NUC-RES和SS相当，而其他CHB患者产生细胞因子的频率较低（图4B，左）。低EI值CHB患者的HBV特异性CD8 T细胞在细胞因子产生方面更有效（图4B，右），细胞因子产生水平与EI值呈负相关（图4C）。HBV特异性CD8 T细胞产生的全部细胞因子与Bcl-2水平呈正相关，与TOX水平呈负相关（图4F）。其他耗竭（PD-1和CD39）和记忆（CD127和TCF-1）标志物也有相同的趋势（但无显著相关性）。

图4：HBV特异性CD8 T细胞的体外功能分析

进一步评估体外抗氧化剂、多酚、PD-1/PD-L1靶向化合物和选择性toll样受体8（TLR8）激动剂对不同EI水平CHB患者的HBV特异性CD8 T细胞的影响。在缺乏这些体外免疫调节剂的情况下，相比高EI值CHB患者，低EI值CHB患者的T细胞系显示出更有效的扩增和细胞因子产生（图5A，B）。所有这些体外免疫调节剂对低EI值CHB患者的HBV特异性CD8 T细胞的影响更显著（图5C-E）。

图5：体外免疫调节剂对HBV特异性CD8 T细胞功能的影响

3. 总CD8 T细胞表型分析可以反映HBV特异性CD8 T细胞的情况

core18-27特异性CD8 T细胞/总CD8 T细胞与PD-1high CD127low/- CD8 T细胞的频率（图6A）、以及分化/耗竭标志物（如Bcl-2和CD39）、转录因子（如TCF-1和TOX）的表达之间均存在显著正相关（图6B）。通过分析总CD8 T细胞中PD-1、CD127、Bcl-2和TOX的不同组合的表达，也发现了与HBV特异性CD8 T细胞中EI计算得出的相同患者分布（图6C，D）。在高EI值CHB患者中，总CD8 T细胞中PD-1high TOXhigh、PD-1high TOXhigh Bcl-2-、PD-1high TOXhigh TCF1-和PD-1high TOXhigh CD127-亚群的频率显著更高。这表明，总CD8 T细胞表型分析可以反映HBV特异性CD8 T细胞的情况，用于区别具有不同抗病毒能力和对体外免疫调节剂应答不同的CHB患者。

图6：总CD8 T细胞群的表型分析

肝霖君有话说

如何有效的判断CD8 T细胞耗竭和恢复的时间点从而更好的指导免疫调节剂的治疗是目前亟需探索的科学问题。本研究中CHB患者的两种HBV特异性CD8 T细胞在外周血频率和表型参数方面存在显著差异，表现出两种不同的耗竭特征。根据耗竭和记忆标志物建立耗竭评分，可区分对体外免疫调节剂应答不同的患者群体。进一步分析总CD8 T细胞中PD-1、CD127、Bcl-2和TOX的不同组合的表达，也能得到相同的患者分布。

基于总CD8 T细胞表型的耗竭评分，为预测CHB患者HBV特异性CD8 T细胞功能提供了一种简化的方法，有助于区分具有不同抗病毒能力和对体外免疫调节剂应答不同的CHB患者群体，未来还需要进一步探索，对其临床适用性进行评估，使更多患者从中获益。

对于慢乙肝患者以及抗病毒治疗的免疫机制的深入探索是为了更加精准的进行治疗决策，针对不同患者能采取更有效的治疗方案，这对于进一步提升CHB患者的临床治愈率也是非常关键的。

参考文献：

Rossi M, Vecchi A, Tiezzi C, et al. Phenotypic CD8 T cell profiling in chronic hepatitis B to predict HBV-specific CD8 T cell susceptibility to functional restoration in vitro [J]. Gut, 2023, 0: 1-15.

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