编者按

肝脏中的抗原提呈细胞（APCs）对T细胞的活化至关重要，但慢乙肝期间APCs发生功能障碍的具体机制及其在聚乙二醇干扰素α（PEG IFNα）治疗期间对HBsAg清除的影响尚不清楚。此外，脾脏和血液循环系统中的红系前体细胞（EPCs）升高会降低机体的抗感染免疫力，CD45阳性的红系前体细胞（CD45+EPCs）具有免疫抑制功能，慢乙肝患者的CD45+EPCs表达高水平的淋巴细胞活化基因3（LAG3，一种免疫检查点分子），定义为LAG3+EPCs。 

近期，中山大学附属第三医院高志良教授团队发表的一项研究发现，LAG3+EPCs通过LAG3和转化生长因子β（TGF-β）导致APCs和T细胞功能障碍，降低PEG IFNα治疗的HBsAg清除率，治疗前较低的LAG3+EPCs水平可能提示临床治愈率更佳，抗-LAG3、抗-TGF-β和PEG IFNα联合治疗有助于提高HBsAg清除率。

研究方法

1.未接受抗病毒治疗的慢乙肝患者及对照组

本研究纳入2021年1月至2021年12月在中山大学第三附属医院52例未接受抗病毒治疗的慢乙肝患者，以检测血液循环中的EPCs水平。慢乙肝的诊断标准符合《慢性乙型肝炎防治指南》。另有24名年龄及性别相匹配的健康人群作为对照组，并对中山大学第三附属医院2020年1月至2021年6月期间接受肝活检的30例慢乙肝患者进行回顾性队列研究，对其石蜡包埋组织进行免疫荧光分析。

2.接受抗病毒治疗的慢乙肝患者组

另纳入97例接受NAs治疗的慢乙肝患者以及31例接受PEG IFNα和NAs联合治疗的慢乙肝患者。在接受NAs治疗的97例患者中，64例参加了慢乙肝临床治愈（珠峰）项目，并接受PEG IFNα和NAs联合治疗，疗程为48周，按照《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》的相关建议进行管理。在PEG IFNα治疗过程中，HBsAg清除定义为HBsAg < 0.05 IU/mL（连续两次检测）。获得HBsAg清除的患者归为“临床治愈”。

研究结果

一、慢乙肝患者的CD45+EPCs占比更高，特别是免疫耐受期及非活动期患者

与健康人群相比，慢乙肝患者血液循环中的CD45+EPCs（CD45+CD71+CD235a+）水平显著更高。其中免疫耐受期及非活动期慢乙肝患者的CD45+EPCs水平高于活动期患者，但CD45-EPCs（CD45-CD71+CD235a+ 细胞）水平相似（图A和B）。

（A）健康供试者（n=24）和慢乙肝患者（n=52）的PBMCs中CD45+EPCs和CD45-EPCs频率及占比；（B）慢乙肝患者中不同分期的CD45+EPCs和CD45-EPCs频率比较

免疫荧光分析证实慢乙肝患者肝组织中CD45+EPCs（CD45+CD71+CD235a+细胞）的数量高于正常肝组织（图F）。

（F）健康供试者及慢乙肝患者肝组织的免疫荧光染色结果

二、探索CD45+EPCs对PEG IFNα应答的影响

1.CD45+EPCs抑制HBV特异性T细胞活化，或与PEG IFNα治疗未获得HBsAg清除有关

与PEG IFNα和NAs联合治疗48周后获得HBsAg清除的患者相比，未获得HBsAg清除的患者血液中CD45+EPCs水平更高（图A）。慢乙肝患者经PEG IFNα和NAs联合治疗后，其CD45+EPCs与HBV特异性CD8+T细胞呈显著负相关（P = 0.037）（图B），且与NAs治疗或未接受抗病毒治疗的慢乙肝患者相比，PEG IFNα和NAs联合治疗的CD45+EPC水平无显著差异（图C）。PEG IFNα和NAs联合治疗前和治疗期间CD45+EPCs的数量没有明显改变（图D），提示抗病毒治疗可能不会影响慢乙肝患者的CD45+EPCs数量，但CD45+EPCs可能与PEG IFNα治疗期间较低的HBsAg清除率有关。

（A）PEG IFNα治疗48周后，健康供试者(HD) (n = 24)、HBsAg清除者(n = 11)和未获得HBsAg清除者(n = 25) PBMCs中CD45+EPCs和CD45-EPCs的频率分析（B）PEG IFNα和NAs联合治疗的慢乙肝患者PBMCs中CD45+EPCs与HBV特异性CD8+ T细胞的相关性分析(n = 17)；（C）未接受抗病毒治疗(Non) (n = 52)、NAs治疗 (n = 97)及PEG IFNα和NAs联合治疗(IFNα + NAs) (n = 31)患者CD45+EPCs的比较分析；（D）PEG IFNα和NAs联合治疗前(pre-tr)及治疗期间(on-tr)患者PBMCs中CD45+EPCs的比较分析(n = 12)

添加来自慢乙肝患者的CD45+EPCs后呈剂量依赖的方式显著降低CD4+及CD8+ T细胞的增殖（图E），且给予CD45+EPCs后，IFN-γ的分泌减少（图F）。随着CD45+EPCs的耗竭，CD8+HBV特异性T细胞的IFN-γ应答能力得到恢复。表明添加同源CD45+EPCs后几乎完全抑制了HBV特异性CD8+T细胞应答能力（图G）。

（E）CD3+T细胞与慢乙肝患者PBMCs中不同比例的CD45+EPCs或CD45-EPCs共培养3天检测到的CD4+和CD8+ T细胞的增殖情况；（F）用ELISA法评估上清液中IFN-γ的产生情况，并分析培养基中IFN-γ的浓度；（G）富集或去除PBMCs中的CD45+EPCs，并与自体PBMCs共培养，检测IFN-γ的生成情况
 

2.加入CD45+EPCs时TGF-β和LAG3高表达，两者可能是抑制HBV特异性T细胞活化的重要因子

（1）加入CD45+EPCs时TGF-β高表达

据报道，CD45+EPCs可以通过产生IL-10、转化生长因子β（TGF-β）、活性氧（ROS）和精氨酸酶来抑制T细胞活性。本研究经ELISA检测及细胞染色实验证实，在添加来自慢乙肝患者的CD45+EPCs情况下TGF-β表达上调，其他因子无明显变化（图H-L）。

（H）CD45+EPCs与T细胞共培养条件下IL-10和TGF-β的含量；（I）健康供试者和慢乙肝患者PBMCs中CD45+EPCs的IL- 10表达情况；（J）健康供试者和慢乙肝患者PBMCs中CD45+EPCs的TGF-β表达情况；（K）慢乙肝患者和健康供试者CD45+EPCs精氨酸酶活性检测；（L）慢乙肝患者和健康供试者CD45+EPCs中的ROS水平

加入抗-TGF-β可以部分阻断CD45+EPCs对T细胞活化的抑制功能，并显著增加HBV特异性CD8+ T细胞的活化（图M-N）。提示慢乙肝患者的CD45+EPCs抑制了HBV特异性T细胞，而这种抑制不仅是由TGF-β造成的，还可能存在其他影响因子。

（M）在CD45+EPCs与T细胞共培养体系中加入TGF-β抗体（10 μg/mL）。检测CD4+和CD8+ T细胞增殖情况，以及IFN-γ的产生成情况。（N）在CD45+EPCs与PBMCs共培养体系中加入TGF-β抗体（10 μg/mL），并用1 μg/mL ProMix™HBV Peptide Pool刺激，通过细胞内细胞因子的产生检测T细胞应答

（2）加入CD45+EPCs时LAG3高表达

研究进一步发现加入慢乙肝患者的CD45+EPCs后高表达LAG3，但加入CD45-EPCs几乎不表达（图A）。AAV/HBV小鼠肝脏和血液循环中的CD45+EPCs也高表达LAG3（图B）。RT-qPCR结果一致（图C-D）。因此将慢乙肝患者的CD45+EPCs定义为LAG3+EPCs。

（A）健康供试者、慢乙肝患者及脐带血的PBMCs中CD45-EPCs和CD45+EPCs的累积LAG3介质荧光强度（MFI）。（B）载体对照和AAV/HBV小鼠模型的脾脏、PBMC、肝脏和骨髓中CD45+EPCs和CD45-EPCs的累积LAG3介质荧光强度（MFI）。（C）采用qRT-PCR方法分析慢乙肝患者和脐带血的PBMCs中CD45-EPCs和CD45+EPCs的LAG3基因表达情况。（D）分析载体对照和AAV/HBV小鼠模型各组织中CD45-EPCs和CD45+EPCs中LAG3基因的表达情况

3. LAG3+EPCs抑制抗原提呈细胞进而影响患者对PEG IFNα的应答

未接受抗病毒治疗的慢乙肝患者的抗原提呈细胞（APCs）主要包括4类：CD14单核细胞（MNs）、CD16 MNs、CD20 B细胞及总树突状细胞（DCs），使用IFNα分别刺激上述4种APCs，深入探索LAG3+EPCs抑制的特异性APCs类型。结果显示，APCs经IFNα预处理后与T细胞共培养，此时APCs具有免疫促进功能。与CD16 MNs和CD20 B细胞相比，CD14 MNs及总DCs对T细胞的促进作用更强。加入LAG3+EPCs处理后降低了APCs对T细胞活化的刺激能力，尤其是CD14 MNs和DCs的。抗-LAG3或抗-TGF-β单独处理仅部分限制了LAG3+EPCs对CD14 MNs和DCs的抑制功能，两者联合处理则消除了LAG3+EPCs对CD14 MNs和DCs的抑制功能（图H）。提示LAG3+EPCs是通过LAG3和TGF-β共同抑制慢乙肝患者中APCs（主要是CD14 MNs和DCs）对PEG IFNα的应答。

（H）检测各类APCs经IFNα、LAG3+EPCs、抗-LAG3及抗-TGF-β处理后的T细胞活性

三、提高临床治愈率的探索
1.抗-LAG3和抗-TGF-β联合应用解除了LAG3+EPCs对HBV特异性T细胞的抑制作用
小鼠实验显示，LAG3+EPCs抑制CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的增殖（图E-F）。抗-LAG3或抗-TGF-β单独处理可以部分逆转LAG3+EPCs的免疫抑制功能。抗-TGF-β及抗-LAG3联合应用则可恢复CD8+T和CD4+T细胞的增殖（图E-F）。细胞实验也显示，抗-LAG3或抗-TGF-β单药处理仅部分限制LAG3+EPCs对HBV特异性CD8+ T的抑制功能。抗-LAG3和抗-TGF-β联合应用则不再对HBV特异性T细胞产生抑制作用（图G）。

小鼠实验显示经抗-LAG3或/和抗-TGF-β处理后检测（E）CD4+ T细胞、（F）CD8+ T细胞增殖情况；细胞实验测定细胞内细胞因子的产生来评估（G）CD8+ T细胞的反应

2.抗-LAG3和抗-TGF-β联合PEG IFNα治疗可提高HBsAg清除率

根据PEG IFNα治疗前慢乙肝患者的LAG3+EPCs水平分为高水平组（> 0.18%）和低水平组（< 0.18%）。LAG3+EPCs高水平慢乙肝患者的HBsAg清除率显著更低（P = 0.0007）（图A）。受试者工作特征（ROC）分析显示，LAG3+EPCs水平能较好预测HBsAg清除率（AUC = 0.735）（图B）。

（A）CD45+EPCs高水平组与低水平组的累积HBsAg清除率（n=64）；（B）根据CD45+EPCs水平预测慢乙肝患者PEG IFNα治疗48周HBsAg清除率的AUC

由此推测抗-LAG3和抗-TGF-β联合治疗可促进免疫应答，抑制HBV持续感染。动物研究显示，与对照组相比，抗-LAG3和抗-TGF-β联合治疗降低了血清HBeAg、HBV DNA水平及肝细胞中HBsAg的表达，血清HBsAg水平无显著变化（图C-E）。提示抗-LAG3和抗-TGF-β联合治疗虽然能显著降低HBV感染，但对降低HBsAg的作用有限。

（C）抗-LAG3和抗-TGF-β处理的动物实验研究方案；（D）检测HBeAg、qHBsAg及HBV DNA水平；（E）对小鼠肝脏中表达HBsAg的肝细胞进行染色并分析qHBsAg阳性染色面积的百分比（棕色）

进一步研究发现在抗-LAG3及抗-TGF-β的基础上，联合PEG IFNα治疗可降低血清HBeAg、HBV DNA和HBsAg水平，以及肝细胞中HBsAg的表达（图F-H），且安全性良好。

（F）抗-LAG3和抗-TGF-β联合PEG IFNα处理的动物实验研究方案；（G）检测HBeAg、qHBsAg及HBV DNA水平；（H）对小鼠肝脏中表达HBsAg的肝细胞进行染色并分析qHBsAg阳性染色面积的百分比（棕色）

  肝霖君有话说

本研究发现LAG3+EPCs在慢乙肝患者中不断积累并与免疫耐受有关。在PEG IFNα治疗过程中，LAG3+EPCs通过TGF-β和LAG3诱导APCs和T细胞功能障碍来抑制HBsAg的清除。治疗前较低的LAG3+EPCs水平有助于筛选出对PEG IFNα应答更佳的慢乙肝患者。仅使用抗-LAG3和抗-TGF-β不能很好地清除HBsAg，联合PEG IFNα能更好地降低血清HBeAg、HBV DNA、HBsAg水平并抑制肝细胞中HBsAg的表达，提示联合PEG IFNα的治疗策略是慢乙肝患者获得临床治愈的重要条件。该研究为慢乙肝的临床治愈提供了一个新的治疗策略，值得进一步探索。

参考文献：  

Pang XQ, Li X, Zhu WH, et al. LAG3+ erythroid progenitor cells inhibit HBsAg seroclearance during finite pegylated interferon treatment through LAG3 and TGF-β[J]. Antiviral Res. 2023; 213: 105592.

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