研究方法 患者基线 三组之间的年龄、性别和ALT水平无明显差异。可能由于抗病毒治疗的原因，未治愈组的HBsAg（p < 0.001）和HBV DNA（p < 0.001）水平显著低于初治组。与初治组相比，未治愈组和临床治愈组的肝脏炎症活动程度显著降低（p = 0.004，p = 0.001），但肝纤维化程度无明显差异。此外，临床治愈组和未治愈组的肝脏炎症活动程度无明显差异。 患者基线 研究结果 临床治愈组的肝内cccDNA水平和肝内HBsAg阳性比例显著更低 临床治愈组的肝内共价闭合环状DNA（cccDNA）中位水平（1.49 log copies/103 cells）相比于未治愈组（2.16 log copies/103 cells，p = 0.004）和初治组（2.71 log copies/103 cells，p < 0.001）显著更低。临床治愈组的肝内HBsAg阳性比例显著低于初治组（0%，0 - 60.3% vs. 66.05%，0.95 - 99.90%，p < 0.001）和未治愈组（0%，0 - 60.3% vs. 17.50%，0 - 71.10%，p < 0.001）。未治愈组的肝内HBsAg阳性比例同样显著低于初治组（p = 0.001）。 临床治愈患者中25.5%仍有HBsAg阳性的肝细胞，HBsAg阳性肝细胞占比为0.1 - 60.3%。肝内HBsAg阳性的患者中，有8.5%的患者cccDNA水平低于LLOQ。临床治愈后肝内cccDNA和HBsAg均清除的患者比例达23.4%。在所有临床治愈患者中，肝内HBcAg的免疫组织学染色均为阴性，表明cccDNA可能不再产生pgRNA。 临床治愈组、未治愈组和初治组的（A）肝内cccDNA（B）肝内HBsAg阳性比例；（C）临床治愈患者中肝内cccDNA和HBsAg状态的分布情况 临床治愈组的肝内HBV DNA整合和转录水平显著低于未治愈组 临床治愈组发生HBV DNA整合事件显著低于未治愈组（47.00 [15.00 - 160.00] vs. 196.00 [92.25 - 452.50]，p = 0.016）。同时，临床治愈组中的HBV DNA嵌合转录本明显低于未治愈组（2.00 [0 - 41.00] vs. 206.00 [113.50 - 439.00]， p < 0.001），提示HBV DNA整合及其转录水平的降低可能与HBsAg清除相关。伴随着总嵌合转录本的减少，肝细胞癌（LIHC）驱动基因中转录活跃的整合事件在临床治愈组中比未治愈组明显更低（0.50 [0 - 8.0] vs. 22.00 [13.00 - 49.00]，p < 0.001）。 临床治愈组和未治愈组（A）HBV DNA整合事件数量（B）HBV DNA嵌合转录本数量肝癌驱动基因嵌合转录本数量 03 临床治愈组的肝内HBV RNA水平显著低于未治愈组 临床治愈组中有 27.8%（5/18）的患者肝内HBV RNA检测不到，而未治愈组均可检测到肝内HBV RNA。临床治愈组的肝内HBV RNA中位水平显著低于未治愈组（1.52 [0 - 3.16] vs. 3.87 [3.64 - 4.15] log copies/103 cells，p = 0.004）。此外，临床治愈组的总HBV RNA reads数相比于未治愈组明显减少（50 [18 - 2485] vs. 15394 [10253 - 29231]，p < 0.001）。 临床治愈组和未治愈组（B）肝内 HBV RNA 水平 （C）总HBV RNA reads数 临床治愈组中肝内HBsAg阴性患者的肝内HBV RNA水平显著更低 在临床治愈组中，肝内HBsAg阴性患者的肝内HBV RNA水平显著低于肝内HBsAg阳性患者（0.98 [0.00 - 1.87] vs. 3.87 [2.24 - 4.71] log copies/103 cells，p = 0.013）。临床治愈组中肝内HBsAg阴性的总HBV RNA reads数显著低于肝内HBsAg阳性的患者（24 [7.50 - 58] vs. 4751 [1726 - 24,486]，p = 0.002）。此外，与肝内HBsAg阴性患者相比，肝内HBsAg阳性患者的残留HBV整合事件（402.00 [90.00 - 569.50] vs. 30.00 [6.75 - 91.00]，p = 0.013）和嵌合转录本（83.00 [19.75 - 244.50] vs. 1.00 [0 - 4.25]，p = 0.005）显著更高。然而，临床治愈组中肝内HBsAg阳性和HBsAg阴性患者之间的cccDNA水平无显著性差异。 肝内HBV RNA主要来源于整合HBV DNA，部分肝内HBsAg阳性患者表现出cccDNA微量转录活性 进一步确定肝内HBV RNA的来源，分析临床治愈组和未治愈组的嵌合转录本与肝内HBV RNA水平之间的相关性，观察到高度相关性（r = 0.924，p < 0.001）。此外，整合HBV DNA水平与肝内HBV RNA水平呈强正相关（r = 0.806，p < 0.001）。相比之下，cccDNA与肝内HBV RNA的相关性较弱（r = 0.534，p = 0.004）。上述结果表明两组的肝内HBV RNA主要来源于整合HBV DNA。此外，对HBV RNA和嵌合转录本覆盖率的分析证实，HBV转录主要源自整合HBV。临床治愈组中部分肝内HBsAg阳性的患者仍有cccDNA微量转录活性。未治愈组均显示出cccDNA转录活性。 肝内HBsAg阳性的临床治愈患者的肝内HBV RNA水平与（A）嵌合转录本（B）整合HBV DNA（C）cccDNA之间的相关性;（D）6例患者的HBV RNA（蓝色）和嵌合转录本覆盖率（粉色） 肝内残留HBsAg且具有cccDNA微量转录活性的临床治愈患者可能存在HBV复发风险 对完成RNA测序的临床治愈患者（n ≥ 18）进行定期随访，4例肝内残留HBsAg的患者仍保留有cccDNA微量转录活性，其中2例出现HBV复发。2例肝内残留HBsAg但无cccDNA微量转录活性的患者，在至少108周的随访期间未发生HBV复发。同样，无肝内残留HBsAg的临床治愈患者（n = 12），在96周（87 - 129）随访期间未发生HBV复发。 对完成RNA测序的临床治愈患者进行随访（A）具有整合HBV转录活性和cccDNA微量转录活性的临床治愈患者（B）仅具有整合HBV转录活性的临床治愈患者 临床治愈后cccDNA和整合HBV DNA的清除有利于降低疾病复发风险。本研究再次证实了获得临床治愈的患者肝内cccDNA水平和HBV DNA整合显著降低（相关链接一、二），且肝内cccDNA和HBsAg均清除的比例达23.4%。此外，临床治愈患者的肝内HBsAg阳性比例和HBV RNA水平同样显著降低，而HBV RNA主要来源于整合HBV DNA。 另外，该项研究的患者是通过PEG IFNα单药或联合NAs治疗策略实现临床治愈的。已有多项探索干扰素清除cccDNA的机制研究，包括通过改变组蛋白的修饰等表观遗传学的方式、通过巨噬细胞分泌的外泌体携带的miRNA作用、依赖于ISG20与APOBEC3A协同作用等来抑制cccDNA（相关链接一、二、三、四）。相信随着未来更多机制相关研究、检测标志物的探索，将会更加接近完全治愈的目标。
参考文献： Gao N, Guan G, Xu G, et al. Integrated HBV DNA and cccDNA maintain transcriptional activity in intrahepatic HBsAg-positive patients with functional cure following PEG-IFN-based therapy[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2023, 58(10): 1086-1098.
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