编者按：目前，PD-1或PD-L1抗体是肿瘤治疗中最常用的免疫检查点抑制剂（ICIs），可恢复CD8T细胞的免疫功能，有效激活抗肿瘤免疫应答，从而达到杀灭肿瘤的作用，但存在耐药的问题。已有研究表明干扰素α（IFNα）与PD-1抗体联合治疗具有协同抗肿瘤作用，可克服PD-1抗体的耐药，恢复甚至增强CD8 T细胞的细胞毒效应，并提高治疗HBV相关肝癌疗效和生存率（相关链接一、二）。
近期，中科院生物物理研究所彭华研究员联合清华大学医学院傅阳心教授在Gut杂志上发表相关研究，结果表明其新开发的基于抗-PDL1的IFNα融合蛋白——抗-PDL1-IFNα异源二聚体能够增强树突状细胞（DCs）功能，打破免疫耐受，与乙肝疫苗联合治疗可诱导慢乙肝小鼠产生持久的抗-HBs免疫应答，有望实现持久的HBsAg清除。
研究方法
人样本来源
肝组织样本来自中国人民解放军总医院第五医学中心，分为健康对照组（n = 6）、非HBV肝病患者（n = 3）和慢乙肝患者（n = 7）。
HBV载体小鼠模型
C57BL/6J小鼠通过尾静脉注射AAV- HBV 1.3病毒（1 × 10 copies/只），经5周或更长时间，选择稳定的HBV病毒携带小鼠（血清HBsAg > 1000 IU/mL）用于实验。在指定的时间内进行小鼠眼眶采血，监测其血清HBsAg、HBeAg、抗-HBs和HBV DNA水平。
融合蛋白治疗和免疫研究
为了验证融合蛋白在小鼠体内的治疗效果，向HBV载体小鼠静脉注射2次抗-PDL1-IFNα异源二聚体（0.1687 nmol），间隔3天。其它融合蛋白（抗-PDL1-IFNα同源二聚体、IFNα-Fc、抗-PDL1）以相同的方式治疗HBV载体小鼠，并使用等摩尔剂量的IFNα和抗-PDL1（由单个亚基确定）。为了去除CD4和CD8 T细胞，在抗-PDL1-IFNα异源二聚体治疗前1天开始，HBV携带小鼠每周2次腹腔注射200 µg抗CD4（GK1.5）和200 µg抗CD8（TIB210）。
研究结果
01 PDL1在慢乙肝患者和HBV小鼠肝脏中的表达显著上调
以往研究表明慢乙肝患者的肝脏中PDL1的表达水平显著高于非HBV肝病患者和健康对照组。首先，用免疫组化方法分析了慢乙肝患者、非HBV肝病患者和健康对照组的肝脏中PDL1的表达。与以前研究一致，慢乙肝患者肝脏中PDL1的表达高于非HBV肝病患者和健康对照组。与野生小鼠相比，HBV感染小鼠肝脏中CD45和CD45细胞上的PDL1水平显著升高。这表明对于感染了HBV的患者和小鼠肝脏内的PDL1会上调。
慢乙肝患者肝脏中PDL1的表达水平高于非HBV肝病患者和健康对照组
其次，HBV感染小鼠的肝脏CD45和CD45细胞上的PDL1水平均高于其它组织。尤其是小鼠肝脏内树突状细胞（DCs）上PDL1的表达水平均高于其它细胞，并显著高于野生小鼠DCs。
这说明慢性HBV感染机制可能由于HBV感染导致肝脏内DCs上的PDL1的表达上调，导致免疫耐受。然而，目前抗-PDL1/PD1作为慢乙肝的辅助治疗并不成功，这表明仅阻断PD1/PDL1信号通路不足以打破慢乙肝引发的免疫耐受。
HBV小鼠不同组织（A）不同细胞（B）上的PDL1表达差异
02 抗-PDL1-IFNα异源二聚体通过肝脏靶向发挥优越的抗乙肝病毒活性
为了克服PDL1介导的免疫耐受，以同源二聚体或异源二聚体的形式制备了抗-PDL1-IFNα融合蛋白，该蛋白可以与PDL1结合并阻断PDL1抑制通路，同时刺激IFNAR信号通路激活DCs。同源二聚体或异源二聚体结合抗-PDL1的亲和力与PDL1相似。并且，抗-PDL1-IFNα对同源二聚体和异源二聚体的亲和力均高于IFNAR1或IFNAR2，提示抗-PDL1-IFNα融合蛋白可能优先与肝脏中的PDL1高表达细胞结合。
抗-PDL1-IFNα融合蛋白的结构示意图，左为同源二聚体，右为异源二聚体
研究进一步比较了不同融合蛋白的抗病毒活性，分别于第一天和第四天向HBV小鼠静脉注射融合蛋白后，发现相比于抗PDL1、IFNα-Fc或抗-PDL1-IFNα同源二聚体，抗-PDL1-IFNα异源二聚体能够显著降低小鼠血清HBsAg和HBeAg水平。异源二聚体对血清HBV DNA的抑制作用更为持久，并且能够显著降低小鼠肝脏内的HBsAg和HBeAg水平。
小鼠血清HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平（E-G）和肝脏HBsAg、HBeAg水平（H）
导致以上差异的原因可能是由于不同融合蛋白的肝脏靶向能力不同。事实上，异源二聚体在肝组织中的浓度远高于同源二聚体或IFNα-Fc，并且异源二聚体的血清浓度在注射后的前几个小时内显著升高。这一结果证实了异源二聚体通过靶向递送增强干扰素α的活性，提示异源二聚体可能是治疗乙肝病毒的优秀候选者。
异源二聚体的肝脏靶向性（D）和血清浓度（E）
03 抗-PDL1-IFNα异源二聚体通过正反馈免疫应答实现协同抗病毒作用，并通过改善DCs功能来克服免疫耐受
进一步探究抗-PDL1-IFNα异源二聚体的抗病毒机制。IFNAR1的HBV携带小鼠经抗-PDL1-IFNα异源二聚体治疗后几乎检测不到抗病毒作用，这表明抗-PDL1-IFNα异源二聚体通过激活IFNAR信号通路发挥抗病毒作用。
IFNAR信号通路对治疗前后的小鼠血清HBsAg水平影响
与IFNα-Fc相比，抗-PDL1-IFNα异源二聚体能够显著增加HBV携带小鼠肝脏微环境中CD45和CD45细胞上PDL1的表达，而PDL1的表达增加又会诱导肝脏内异源二聚体的特异性聚集，这表明抗-PDL1-IFNα异源二聚体通过正向协同作用，进一步增强其肝脏靶向性，从而更好的抑制HBV复制。
抗-PDL1-IFNα异源二聚体增强肝脏CD45和CD45细胞上PDL1的表达
此外，抗 PDL1-IFNα异源二聚体治疗显著提高HBV小鼠肝脏DCs上CD86, CD80和MHC I的表达水平，促进DCs的发展成熟，增强其抗原交叉呈递和共刺激T细胞激活的潜力。
抗 PDL1-IFNα异源二聚体增强肝脏DCs上CD86、CD80和MHC I的表达水平
以上研究结果表明，抗-PDL1-IFNα异源二聚体通过正向协同作用更好地靶向肝细胞，以激活IFNAR信号通路抑制HBV，同时促进DCs成熟和抗原呈递功能，从而改善HBV特异性T细胞的功能，这些为打破HBV诱导的免疫耐受提供窗口。
04 抗-PDL1-IFNα异源二聚体可打破慢乙肝小鼠对乙肝疫苗的耐受性
探究抗-PDL1-IFNα异源二聚体对HBsAg/CpG疫苗接种的影响，是否会引起慢乙肝小鼠的免疫应答。结果表明，只有先注射抗-PDL1-IFNα异源二聚体再接种HBsAg/CpG疫苗才能诱导小鼠肝脏、淋巴结和脾内强烈的HBsAg特异性T细胞和B细胞免疫应答，而先接种HBsAg/CpG疫苗后注射抗-PDL1-IFNα异源二聚体未观察到类似现象。可见预先注射抗-PDL1-IFNα异源二聚体可以打破慢乙肝小鼠对乙肝疫苗的耐受性，从而实现有效的疫苗接种。
先接种乙肝疫苗后注射抗-PDL1-IFNα（A）先注射抗-PDL1-IFNα后接种乙肝疫苗（B）
注射抗-PDL1-IFNα后接种乙肝疫苗引起小鼠的特异性T细胞和B细胞免疫应答
05 联合疗法诱导的HBsAg特异性体液免疫和细胞免疫应答可中和HBV，预防乙肝病毒再感染
在慢乙肝小鼠模型中，联合治疗组（抗-PDL1-IFNα异源二聚体联合HBsAg/CpG疫苗）的HBsAg水平下降显著，而单一治疗组无明显下降。此外，联合治疗组的抗-HBs水平显著升高并且持久性佳。经联合治疗的小鼠产生了强烈的HBsAg特异性B细胞应答，并获得了长期的免疫细胞记忆，有助于预防乙肝病毒再感染。综上，联合治疗可诱导持久的抗-HBs免疫应答，达到慢乙肝的临床治愈和预防再感染目的。
联合治疗组和单一治疗组的血清HBsAg与抗-HBs水平
肝霖君有话说
这项研究揭示了几种机制，为未来慢乙肝的治疗提供了关键线索。首先，抗-PDL1-IFNα异源二聚体治疗是一种有限疗程的疗法，它可以通过阻断免疫检查点诱导PDL1上调进一步增强肝脏靶向效应和增强DCs功能来改善免疫调节功能，从而打破PDL1介导的免疫耐受，达到协同抗病毒作用。
其次，抗-PDL1-IFNα异源二聚体通过激活先天免疫细胞和获得性免疫细胞来促进乙肝疫苗诱导的HBsAg特异性T细胞和B细胞应答，从而打破对乙肝疫苗的耐受性。因此，抗-PDL1-IFNα异源二聚体联合乙肝疫苗可以诱导高水平、持久的抗-HBs免疫应答，有望实现长期的HBsAg清除。
目前，PD-1/PD-L1抑制剂治疗慢乙肝的相关研究也正如火如荼进行中（相关链接），若能与现有聚乙二醇干扰素α（PEG IFNα）合理有效联用，可能可以为更好的实现慢乙肝临床治愈提供一种非常具有前景的联合治疗策略。
参考文献：
Meng CY, Sun SY, Liang Y, et al. Engineered anti-PDL1 with IFNa targets both immunoinhibitory and activating signals in the liver to break HBV immune tolerance[J]. Gut, 2022.
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