编者按：目前HBV感染仍是全球重要的公共卫生问题。牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）是HBV进入肝细胞所需的受体之一。HBV进入肝细胞后形成共价闭合环状DNA（cccDNA），cccDNA半衰期较长，无需新的病毒进入肝细胞即可自我补充，保持一定数量的转录模板。因此，抑制HBV进入肝细胞在预防HBV感染中至关重要。

早前日本研究团队已证实了在聚乙二醇干扰素α（PEG IFNα）治疗期间，血清miR-6126水平的升高预示着HBsAg的降低，且体外实验也说明了miR-6126能够抑制HBsAg的产生和HBV复制。这表明miR-6126具有抑制HBV病毒活性的潜力，但潜在机制尚不清楚。

近期，该研究团队的最新成果发表在Gene上，通过体外实验探索miR-6126是否下调了NTCP的表达水平，结果显示：转染miR-6126降低了HepG2-NTCP细胞中NTCP的表达水平，且miR-6126下调了NTCP mRNA的表达，这与miR-6126抑制HBV进入肝细胞有关。

研究方法

HepG2-NTCP细胞是过表达牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）-1的肝癌细胞株，用于评估转染miR-6126后NTCP的表达水平和PreS1附着在NTCP上的情况。TaqMan基因表达分析用于检测NTCP和β-肌动蛋白（β-actin）的基因表达水平。Western blot分析和免疫染色法评估NTCP蛋白表达水平。

人原代肝细胞PXB细胞从接种PHH的尿激酶型纤溶酶原激活物转基因/SCID小鼠中分离出来，用于验证miR-6126对PreS1附着在NTCP的抑制作用。酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养上清液中HBsAg水平，以评估HBV进入肝细胞的减少程度。

评估NTCP mRNA的稳定性，以确定NTCP mRNA下调的原因。计算治疗组和对照组之间miRNA表达水平的差异倍数。

研究结果

01  miR-6126抑制了NTCP表达和PreS1抗原附着于细胞表面

Western blot分析表明在HepG2-NTCP细胞中50 nm的miR-6126抑制了NTCP表达，而50 nm的miR-6126抑制剂会增强NTCP表达水平。免疫染色法也表明了50 nm的miR-6126抑制了NTCP表达。基于胞浆的面积比例，NTCP染色的面积随miR-6126转染而显著降低。

转染miR-6126后HepG2-NTCP细胞和人原代肝细胞PXB细胞中PreS1抗原对细胞表面的附着下降。

图1：Western blot分析（A）和免疫染色法（B）评估NTCP表达水平

02  miR-6126降低了NTCP mRNA的稳定性及HBsAg水平

在HepG2-NTCP细胞中，通过放线菌素D（5 μg/mL）抑制mRNA合成，miR-6126转染组的NTCP残留mRNA的下降比阴性对照组更快。

在PXB细胞中，miR-6126转染组的HBsAg水平显著低于阴性对照组。

图2：miR-6126转染组与阴性对照组的NTCP mRNA稳定性和HBsAg水平

03  miR-6126引起转录组变化和miRNA表达谱改变，下调了NTCP mRNA的表达水平

在NTCP的3'UTR、5'UTR和CDS序列中，使用miRNA目标序列motif来搜索，均未发现miR-6126可能的靶点。

在HepG2-NTCP细胞中转染miR-6126后，与阴性对照相比，4个mRNAs表达水平上调，25个mRNAs表达水平下调。转录组数据已上传NCBI数据库（登录号：GSE192617）。

图3：miR-6126转染24小时后的转录组分析

miRNAs微阵列分析表明miR-6126等9个miRNAs上调，7个miRNAs下调。miRNA芯片数据已上传NCBI数据库（登录号：GSE180543）。

图4：miR-6126转染24小时后的miRNAs微阵列分析

肝霖君有话说

本研究发现HepG2-NTCP细胞转染miR-6126后NTCP的表达水平下调、并且miR-6126通过降低NTCP mRNA稳定性从而下调其mRNA水平。PXB细胞转染miR-6126后PreS1抗原附着于细胞表面减少，且HBsAg水平显著下降。这表明miR-6126可通过下调NTCP，抑制HBV进入肝细胞，从而减少cccDNA合成。而之前的研究已显示在聚乙二醇干扰素α治疗期间，血清miR-6126水平的升高预示着HBsAg的降低。

已有多项研究也对干扰素α清除cccDNA的机制进行了探索，郭巨涛教授团队发现干扰素α可通过诱导募集到cccDNA微染色体上的三种细胞蛋白来改变组蛋白翻译后修饰，并协同抑制cccDNA转录（相关链接）。宁琴教授团队揭示IFNα可通过介导细胞外泌体miRNA清除cccDNA（相关链接）。张晓东教授团队发现干扰素α可抑制cccDNA上GCN5介导的组蛋白琥珀酰化作用从而通过表观遗传调控来清除cccDNA（相关链接）。目前基于聚乙二醇干扰素α的治疗策略可提升慢乙肝临床治愈率，对其作用机制的深入探索研究将有助于进一步优化治疗方案，推进治愈率的进一步提升。

参考文献：

Fujita K, Nishitsuji H, Iwama H, et al. Pegylated interferon therapy-related microRNA-6126 downregulates sodium taurocholate cotransporting polypeptide expression in hepatocytes [J]. Gene, 2022, 22: 147068

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