编者按:目前用于治疗HBV感染的抗病毒药物主要包括核苷和干扰素α两大类,两者合理联用已可以实现临床治愈。乙肝的完全治愈(包括cccDNA和整合HBV DNA的清除)还无法实现,实现完全治愈主要有两种策略:一是通过安全清除受感染的肝细胞,这需要通过诱导免疫调节来实现;二是通过清除cccDNA或永久沉默cccDNA转录。因此,基因编辑类药物也成为了研发热点,当然机会和风险是并存的,基因编辑类药物研发的难度也大,目前都仅在临床前研究阶段。

2022年9月,Beam Therapeutics在2022国际HBV会议上公布了在研乙肝基因编辑类新药胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的完整临床前数据,CBE通过靶向cccDNA和整合HBV DNA可有效降低病毒生物标志物并防止病毒反弹。

【新药进展】乙肝基因编辑新药临床前结果发布,离乙肝完全治愈还有多远?

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技术背景

01  碱基编辑策略通过在HBV基因组中引入终止密码子实现HBV治愈

CBE可以靶向HBV基因组的cccDNA和整合HBV DNA,在不引起双链DNA断裂(DSB)的情况下将特定DNA碱基直接、不可逆地转化为另一个碱基,从而引入精确和永久的终止密码子/错义突变,在达到沉默HBV基因的同时最大限度地减少染色体重排/缺失风险。

基于碱基编辑技术可以解决慢乙肝的两个关键问题:1) 通过在cccDNA中引入永久性突变防止HBV反弹;2) 在无DSB的情况下,不可逆地沉默来源于整合HBV DNA的HBsAg表达。

02  CBE无需双链断裂即可将C-G转换为T-A

转换步骤:A:从DNA序列的目标碱基对C : G开始;B:CBE由部分失活的CRISPR蛋白与脱氨酶融合而成,经向导RNA(gRNA)引导至目标基因组的DNA序列上并暴露出狭窄的编辑窗口;C:脱氨酶通过脱氨作用将靶胞嘧啶(C)化学修饰为尿嘧啶(U),Cas酶则在相反链上形成切口;D:尿嘧啶(U)被DNA聚合酶解读为胸腺嘧啶(T),修复DNA链缺口,完成C : G到T : A碱基对的转换。

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C-G转换为T-A

临床研究结果

01  BE4/gRNAs(S1 + C2)有效降低细胞模型中HBV相关标志物并防止病毒反弹

BE4/gRNAs(S1 + C2)包含两个gRNA,可引导碱基编辑器BE4同时靶向HBs(gRNA S1)和PreCore(gRNA C2)并在其DNA中引入终止密码子。在HBV感染的人肝癌HepG2-NTCP细胞中,相比靶向无关基因PCSK9的BE4,BE4/gRNAs(S1 + C2)可导致HBV相关标志物(HBsAg、HBeAg、HBV DNA、3.5kb RNA)的大幅降低;BE4/gRNAs(S1 + C2)联合拉米夫定可使碱基编辑率提高20%,对HBV相关标志物的抑制作用更明显。进一步研究表明,BE4/gRNAs(S1 + C2)通过编辑cccDNA发挥作用,并不降低cccDNA水平。

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碱基编辑治疗可降低HepG2-NTCP细胞中HBV相关标志物

在原代肝细胞(PHH)中使用HBV DNA qPCR技术评估HBV病毒的复制,发现停用拉米夫定会导致HBV反弹,而停用BE4/gRNAs(S1 + C2)可防止病毒反弹。通过对cccDNA富集样本的碱基编辑率进行评估,发现经BE4/gRNAs(S1 + C2)处理后约55%的HBs和80%的PreCore基因被成功编辑。

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不同药物停药后HBV DNA水平的变化

02  BE4/gRNA S1抑制自然整合HBV DNA的HBsAg表达

PLC/PRF/5细胞系是具有自然整合HBV DNA的肝癌细胞系,在第1天转染BE4 mRNA和gRNA S1,第7天测定细胞外HBsAg水平。结果显示BE4/gRNA S1可使约50%的HBs基因被编辑,细胞外HBsAg水平大幅降低。

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碱基编辑治疗降低自然整合HBV DNA的HBsAg表达

03  BE4/gRNAs(S1 + C2)导致HBV小鼠模型中病毒标志物的持续减少

HBV小鼠接受脂质纳米颗粒(LNP)递送的BE4/gRNAs(S1 + C2)1剂或2剂作为试验组,BE4/PCSK9 1剂或2剂以及恩替卡韦口服两周作为对照组。在第一次注射后第35天:BE4/gRNAs(S1 + C2)治疗组HBsAg平均下降> 2 log,9只小鼠中有6只的HBsAg降至检测限以下;BE4/gRNAs(S1 + C2)治疗组血清HBV DNA持续降低> 3 log,2剂相比1剂对HBV DNA的抑制作用更强,停药后未观察到反弹;恩替卡韦治疗也能抑制HBV DNA的复制,但停药后DNA水平立即反弹;BE4/gRNAs(S1 + C2)治疗组所有小鼠在第一次注射后两周HBeAg水平降至最低检测限以下。

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碱基编辑治疗持续降低HBV小鼠模型中的病毒标志物

总结

经双重碱基编辑技术在HBV基因HBs和PreCore中引入终止密码子可有效降低细胞及小鼠模型中HBV相关标志物如HBsAg、HBeAg、HBV DNA和3.5kb RNA水平,防止停药后HBV的再激活。碱基编辑治疗可能通过引入阻止HBV复制和沉默病毒蛋白表达的碱基突变,永久灭活cccDNA和整合HBV DNA,为实现慢乙肝的完全治愈带来新的希望。

肝霖君有话说

由于HBV感染宿主后形成的cccDNA十分稳定,且部分HBV DNA能整合到人类基因组中,导致对HBV的完全清除十分困难,慢乙肝的完全治愈至今未能实现。而基因编辑技术能直接靶向致病基因,在治愈许多难治性疾病包括慢乙肝方面展现出了巨大潜力。

目前针对慢乙肝的基因编辑药物共有3个,均长期处于临床前研究阶段。基因编辑药物的研发同时也充满了挑战。首先是基因编辑效率问题,我们需要将基因编辑所需要的蛋白质、酶、mRNA、gRNA等特异性递送至受感染的肝细胞,继而产生碱基转换、基因敲入/敲除等以修复或沉默致病基因。但现有递送载体的传递效率低下、载体容量小、靶向特异组织能力不足、基因编辑的工具酶效率低等都会导致基因编辑效率低,部分致病基因未能实现编辑从而无法完全清除病毒基因组,如本文中BE4/gRNA的碱基编辑率在50% - 80%之间,未实现100%编辑,进而也未实现对所有研究对象HBsAg的彻底清除。其次是脱靶效应,即除了编辑目标基因以外,还可能识别非目标区域但具有相似碱基序列的基因进行编辑,从而改变正常的基因组。人类大约有2 - 3万个基因,但整个基因组间的差异不足1%。要在如此多的基因中实现对特定基因的编辑难度较高,基因编辑的脱靶率也较高,从而引发一系列的不良反应,严重时甚至可能危及生命,且目前也缺少能在全基因组范围内检测脱靶的高灵敏方法,所以安全性将是阻碍基因编辑药物发展的另一大难题。此外,基因编辑作为一种新兴技术,目前还处于早期发展阶段,基因编辑策略的优化和过程控制都还需进一步探索,前期药物开发的经验也十分匮乏,故相比传统药物在开发周期、人力、物力等方面耗费更多,推进也更难。

尽管基因编辑疗法的开发困难重重,现阶段人们对基因编辑技术的争议颇多,但相信随着众多科研人员的深入研究与打磨,基因编辑有望被有效而安全地运用于治病救人,造福世界。

在目前完全治愈还无法实现的情况下,应积极追求临床治愈以最低化远期不良结局风险,而不能盲目的等待新药的上市。最近也有相关研究发现相当一部分临床治愈的慢乙肝患者实现肝内cccDNA清除,HBV整合显著降低(相关链接)。因此是否通过更高敏的HBsAg检测手段可以让临床治愈更接近完全治愈,这也是目前积极探索的课题(相关链接)。

参考文献:

Smekalova E, Martinez MG, Combe E, et al. Cytosine base editing inhibits Hepatitis B Virus replication and reduces HBsAg expression in vitro and in vivo. 2022 International HBV Meeting.

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