由于技术发展所限,现有技术手段还没办法彻底根除细胞内的乙肝病毒(HBV)cccDNA,cccDNA在细胞内的持续存在给乙肝病毒蛋白的持续表达提供了源泉,并且致使部分慢性乙型肝炎病毒感染发展为肝癌,提示目前的治疗策略仍有较大的局限性,需要开发新的治疗策略以解决问题。  

基因沉默技术在处理乙肝病毒感染上有可能是一项有价值的策略,乙肝病毒(HBV)X基因(HBX)由于其末端共定位(co-terminallocalization),可能是一个基因沉默技术最佳的靶标。  

EASL2021:Gapmers 和/或 siRNA 联合或可作为基因疗法用于HBV感染

在2021年的欧洲肝病学会年会上,来自巴塞罗那瓦勒德希伯伦大学医院(VallD’hebronUniversityHospital)等研究机构的研究人员介绍了一种基于反义锁核酸(LNA)Gapmer(GP)和靶向HBX超保守区域的siRNA基因治疗策略。  

首先,研究人员将HepG2-NTCP细胞用2.5%DMSO处理至少14天,然后通过在37oC环境下以500个基因组当量的HBV进行感染旋转接种(spinoculation)1h,并孵育过夜。在感染后第48h或第5天,使用TransIT-X2(Mirus)用Gapmer(GP)(50nM的GP1和/或GP4,Qiagen)和/或siRNA(50nM)处理感染的细胞。每个实验中都使用了一个加干扰的对照Gapmer。  

处理72小时后收集细胞和上清液。通过RNAeasyPlus微型试剂盒(Qiagen)从细胞中提取前基因组RNA(pgRNA),并使用TaqMan探针(Roche,Lightcycler?480)通过RT-qPCR进行定量。通过化学发光酶法(Roche,COBAS?8000)对上清液中的HBsAg和HBeAg进行定量。  

研究结果显示,感染后早期(在感染后48h时),GP1处理使pgRNA、HBeAg和HBsAg的抑制率均超过70%(分别为75.5±9.9%;74.7±6.4%和72.4±7.7%)。  

不同的是,GP4的抑制作用比GP1低7.4到13个百分点(pgRNA、HBeAg和HBsAg分别为62±17%;66.1±11.2%和64.7±12%)。  

当GP在感染后稍晚期(感染后第5天)引入时,GP1和GP4对pgRNA的抑制作用均降低(分别为53.5±29%和58.5±17%)。  

如果考虑病毒蛋白表达,则效率较低(两种GP均低于48%)。  

值得注意的是,两种GP或GP与siRNA的组合提高了pgRNA的抑制效率(GP1+GP4;GP1+siRNA;GP4+siRNA分别为69.1±16.5%;66.7±12.2%;63.8±21%),只是部分改善病毒蛋白抑制。  

综上数据,研究认为在体外环境中Gapmers似乎是抑制HBV表达的有价值的分子。通过将GP相互组合或与针对同一超保守区域的siRNA组合,可以提高它们在建立生产性感染(5dpi)后的有限效率。  

然而,研究人员认为还需要进一步的实验来证实这些结果,并测试其他递送系统以提高治疗效率。(更多肝病新药研究信息敬请关注“肝脏时间”微信公众号)!


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