编者按：慢乙肝的完全治愈需要达到cccDNA和整合HBV DNA的清除，而现有抗病毒药物均不直接作用于cccDNA或整合HBV DNA，慢乙肝的完全治愈暂时无法实现，慢性HBV感染仍然是一个全球性的公共卫生威胁。

2022年12月，罗氏上海创新中心的研究人员在Journal of Hepatology 杂志首次报道了靶向cccDNA的口服小分子抑制剂ccc_R08，其在细胞和小鼠模型中对cccDNA的强效抑制作用有可能为治愈HBV感染提供一种新的途径。

研究方法

采用HBV感染的原代人肝细胞（PHHs）筛选新型cccDNA抑制剂，采用HBVcircle小鼠模型评估所发现的cccDNA抑制剂的抗HBV疗效，通过正向和反向药理学研究方法探讨cccDNA抑制剂的作用机理。

研究结果

01  经高通量筛选鉴定出一种新型HBV cccDNA抑制剂

通过对HBV感染的PHHs进行高通量筛查，共筛选了84.6万个小分子化合物。最终发现cccDNA抑制剂ccc_R08可剂量依赖性地降低细胞外HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平以及细胞内HBV DNA和RNA水平，IC50值约为0.2 - 5 μM。为阐明ccc_R08的作用机制，从PHHs中提取Hirt DNA并使用Southern blot和real-time PCR法检测cccDNA水平，发现ccc_R08在两项试验中均以剂量依赖性的方式显著降低cccDNA水平。

ccc_R08的化学结构及对PHHs中cccDNA水平的影响

02  ccc_R08特异性抑制HBV，安全性良好

ccc_R08对来自不同组织的不同细胞系没有明显的细胞毒性。对HEp-2和HEK293细胞在内的多种细胞系的细胞增殖及细胞周期无明显影响。

03  ccc_R08治疗导致HBVcircle小鼠模型中血清HBsAg及pgRNA、肝内cccDNA水平持续降低

为了评估ccc_R08的体内疗效，采用了一种创新的HBVcircle小鼠模型，该模型通过流体动力学注入细菌重组机制产生的cccDNA样分子。HBVcircle小鼠可持续产生高水平的血清HBsAg。小鼠口服给予20 mg/kg的ccc_R08或媒介物每天两次，持续2周。ccc_R08组血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平下降至最低水平且在停药随访5周内维持低水平。随访结束时，小鼠肝脏中cccDNA水平检测不到，表明cccDNA被清除。未观察到药物对小鼠体重的影响，表明ccc_R08对cccDNA的作用通过非细胞毒机制介导。

HBVcircle小鼠模型中ccc_R08的抗HBV活性

为研究ccc_R08是否可以降低循环中的pgRNA水平及其与cccDNA的相关性，HBVcircle小鼠每天两次接受不同剂量的ccc_R08治疗，持续42天，停药随访14天。ccc_R08对血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA的抑制作用呈剂量依赖性。ETV治疗导致HBV DNA显著减少，但对HBsAg、HBeAg、pgRNA或cccDNA无明显影响。相反，ccc_R08可剂量依赖性地显著降低血清pgRNA水平，且不同剂量下pgRNA的减少与肝脏cccDNA的减少在数量上相关。此外，小鼠血浆ccc_R08浓度与HBsAg、HBeAg、HBV DNA和pgRNA的降低呈良好相关性。以上结果支持使用pgRNA作为血清生物标志物来代表肝脏中cccDNA的水平和转录活性。

HBVcircle小鼠模型中ccc_R08对血清pgRNA水平的影响

04  通过正向和反向药理学探讨ccc_R08的作用机理

在正向药理学研究中，ccc_R08显著降低了HBV基因的总表达量，对HBV转录调控呈时间依赖性；ccc_R08显著调控了大量宿主基因，通过调节宿主基因的表达进一步抑制了HBV基因表达，提示其抗HBV作用很可能是通过调控宿主基因介导的。为了筛选可能导致ccc_R08诱导cccDNA减少的基因，共确定了67个既与HBV cccDNA潜在功能相关又受ccc_R08转录调控的基因。在反向药理学研究中，分析确定了21个可能与ccc_R08作用方式相关的宿主蛋白，其中13个能削弱、8个能增强ccc_R08抑制cccDNA的能力。整合正向和反向药理学结果构建生物网络，发现其中四个基因ATM、CHEK1、CHEK2和TOP2A为化合物抑制HBV cccDNA的因果靶点，两个参与细胞周期和转录的关键转录因子JUN和E2F1也可能受到ccc_R08的调控。ccc_R08对HBV cccDNA抑制作用的单一作用机制暂不明确。

肝霖君有话说

受感染肝细胞中cccDNA的持续存在是乙肝暂无法完全治愈的主要原因。小分子ccc_R08直接靶向cccDNA，在体外细胞和体内小鼠试验中均显著降低了cccDNA水平，有潜力作为未来治愈慢性HBV感染的一种新方法，但目前仍在临床前研究阶段，是否能在临床研究阶段表现出同样的效力还有待考察。另外直接靶向cccDNA药物是否能清除整合HBV DNA以及由此产生的HBsAg，这仍然是值得关注的（相关链接）。

在研的基因编辑类药物能同时靶向cccDNA和整合HBV DNA，在治愈慢乙肝方面展现出了巨大潜力，但基因编辑药物研发难度大，目前均处于临床前研究阶段。并且由于基因编辑效率问题和脱靶效应等，基因编辑药物的开发也充满挑战（相关链接）。

总之，慢乙肝完全治愈道阻且长。在当前临床治愈可以实现的前提下，患者可积极追求临床治愈。研究发现，临床治愈的患者中有27%可获得cccDNA清除，整合HBV DNA显著降低（相关链接），可能是最接近完全治愈的目标，同时可最低化远期不良结局风险，显著提高患者的生活质量。

参考文献：

Wang L, Zhu Q, Zhang JD, et al. Discovery of a first-in-class orally available HBV cccDNA inhibitor. J Hepatol. 2022: S0168-8278(22)03466-3.

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